Wskaźniki biologiczne (BI) są rodzajem wskaźników sterylizacji, które zawierają zdolne do życia drobnoustroje mające zdefiniowaną oporność na określony proces sterylizacji. Wskaźniki biologiczne zawierają drobnoustroje wzorcowe – szczepy mikrobiologiczne uzyskane z uznanej kolekcji hodowlanej. Oporność na inaktywację drobnoustroju wzorcowego umieszczonego w teście biologicznym opisywana jest przez wartość D10 – czas lub dawkę wymaganą do osiągnięcia inaktywacji 90 % populacji badanych drobnoustrojów w ustalonych warunkach. Testy biologiczne wykorzystywane są do kontroli procesu sterylizacji w autoklawie. Przyjmuje się, że testy biologiczne pozwalają na bezpośrednią ocenę bójczości procesu sterylizacji – ten rodzaj kontroli pozwala wprost wykazać, że temperatura i czas sterylizacji pozwalają na skuteczną redukcję drobnoustrojów i stanowią ważny element kwalifikacji autoklawu lub walidacji procesu sterylizacji. Kontrola sterylizacji z wykorzystaniem testów biologicznych prowadzona jest zarówno podczas odbiorów nowych autoklawów, jak i jako element okresowej oceny sterylizatora. Sporal A jest popularnym rodzajem testu biologicznego stosowanego w kontroli sterylizacji. Coraz większą popularność zyskują jednak testy biologiczne ampułkowe, w przypadku których nie jest konieczne wykonywanie posiewu mikrobiologicznego – tego rodzaju test biologiczny, obok drobnoustroju testowego (w przypadku sterylizacji parowej – Geobacillus stearothermophilus), zawiera również pożywkę mikrobiologiczną TSB. Po wykonaniu kontroli sterylizacji, test biologiczny jest miażdżony co powoduje zmieszanie się drobnoustrojów z pożywką. Jeśli proces sterylizacji w autoklawie przeszedł poprawnie, test biologiczny pozostaje koloru fioletowego. Jeśli test biologiczny zmienił kolor na żółty, oznacza to że proces sterylizacji nie był wystarczający dla wymaganej redukcji przetrwalników obecnych we wskaźniku biologicznym.

wskaźnik biologiczny sterylizacja
wskaźnik biologiczny sterylizacja

Wybór odpowiedniego wskaźnika sterylizacji dla danego stosowanego procesu jest elementem krytycznym. W powszechnym użyciu jest wiele różnych procesów sterylizacji, a wytwórcy wskaźników biologicznych nie są w stanie przewidzieć wszystkich możliwych zastosowań ich produktu. Dlatego wytwórcy oznaczają testy biologiczne zgodnie z ich przeznaczeniem. Użytkownicy wskaźników biologicznych są odpowiedzialni za wybór, zastosowanie, odzysk i interpretację wyników odpowiednio do danego stosowanego procesu sterylizacji.

Na działanie testu biologicznego procesu sterylizacji mogą niekorzystnie wpływać warunki przechowywania i transportu przed jego użyciem, nieodpowiednie/niewskazane użycie wskaźnika biologicznego lub parametry procesu w sterylizatorze. Ponadto procedura inkubacji testu biologicznego stosowana po ekspozycji na proces, w tym temperatura inkubacji i rodzaj podłoża hodowlanego, dostawca i określona seria, mogą wpływać na zmierzoną oporność jako funkcję odzysku i wzrostu. Z tych powodów zaleca się postępować zgodnie z zaleceniami wytwórcy wskaźnika biologicznego procesu sterylizacji dotyczącymi transportu, przechowywania i stosowania. Przeniesienie aseptyczne po ekspozycji (jeśli dotyczy) i inkubacja wskaźników biologicznych, jak określił to wytwórca wskaźnika biologicznego, są elementami krytycznymi do uzyskania prawidłowych wyników. Ważne jest zwrócenie uwagi, że testy biologiczne do autoklawu nie są przeznaczone do wskazania, że będące w sterylizowanym wsadzie produkty są sterylne. Wskaźniki biologiczne są wykorzystywane do badania skuteczności danego procesu sterylizacji i użytego sprzętu, przez ocenę bójczości mikrobiologicznej zgodnie z koncepcją poziomu zapewnienia sterylności. Konieczne jest odpowiednie szkolenie personelu prowadzącego te badania.

Testy biologiczne nie są przeznaczone do stosowania w jakimkolwiek procesie sterylizacji, innym niż został określony przez wytwórcę wskaźnika biologicznego na oznakowaniu produktu. Gatunki drobnoustrojów i szczepy wybiera się do stosowania jako testy biologiczne procesu sterylizacji na podstawie ich znanej oporności na określoną metodę sterylizacji. Zastosowanie niewłaściwego może dać mylące wyniki.

 

Zalecenia dotyczące stosowania wskaźników biologicznych w autoklawie

Zaleca się, aby użytkownik upewnił się, że test biologiczny został zakwalifikowany do stosowania w określonym zakresie stosowanych warunków sterylizacji. Może to wymagać dodatkowych informacji oprócz informacji podanych na etykiecie. Gdy wskaźniki sterylizacji stosuje się poza warunkami referencyjnymi, użytkownik może wymagać informacji o reakcji oczekiwanej od wskaźnika, np. wpływ  niższych niż optymalne warunków wilgotności na wskaźniki biologiczne stosowane w procesie na tlenek etylenu. Zaleca się, aby użytkownicy, którzy stosują testy biologiczne poza wskazanymi na oznakowaniu zaleceniami wytwórcy, dokładnie scharakteryzowali oporność wskaźników biologicznych na określony proces sterylizacji. Zaleca się wyraźnie wykazać zależność odpowiedzi wskaźnika biologicznego na parametry procesu.  Wskaźnik biologiczny do autoklawu przedstawia obciążenie mikrobiologiczne dla procesu sterylizacji i jest stosowany w celu sprawdzenia, czy proces sterylizacji ma zdolność inaktywacji drobnoustrojów, które mają znaną oporność na określony proces sterylizacji. Drobnoustroje testowe wykorzystywane we wskaźnikach biologicznych zazwyczaj mają oporność na sterylizację, która przewyższa oporność drobnoustrojów zwykłego zanieczyszczenia mikrobiologicznego, chociaż niektóre drobnoustroje mogą wykazywać oporność na sterylizację przekraczającą oporność drobnoustrojów testowych. Odpowiedni test biologiczny stanowi dla procesu sterylizacji obciążenie, które przewyższa zanieczyszczenie mikrobiologiczne poprzez połączenie populacji i oporności. Jeżeli jest powód, by sądzić, że przetwarzane przedmioty mogłyby zostać zanieczyszczone szczególnie opornymi drobnoustrojami, to może być wymagane wydłużenie przetwarzania w procesie sterylizacji, oparte na zanieczyszczeniu mikrobiologicznym.

Zaleca się, aby użytkownik odpowiedzialny za sterylizację produktu upewnił się, że rodzaj wskaźnika biologicznego zastosowanego do walidacji i/lub rutynowego monitorowania danego procesu sterylizacji jest odpowiedni do tego zastosowania.

Zaleca się zawsze przestrzegać zaleceń wytwórcy dotyczących transportu, przechowywania i stosowania testów biologicznych. Nieprawidłowość może naruszyć charakterystyki działania testu biologicznego. Jeśli użytkownik usuwa zaszczepiony nośnik z pierwotnego opakowania wskaźnika biologicznego lub dodaje dodatkowe opakowanie do pierwotnego opakowania, to mogą wystąpić zmiany w charakterystyce oporności. Zaleca się zasięgnąć wytycznych od wytwórcy odnośnie do zakresu tej zmiany lub użytkownik może ocenić zmiany w charakterystykach oporności. Zaleca się, aby użytkownik udokumentował, że charakterystyki działania zaszczepionego nośnika są odpowiednie do ich zastosowania.

Zaleca się, aby:

  • nie stosować wskaźników biologicznych po upływie daty ważności ustalonej przez wytwórcę.
  • użytkownicy, którzy stosują wskaźniki biologiczne do opracowywania, walidacji i/lub rutynowego monitorowania procesu sterylizacji, zostali odpowiednio przeszkoleni w zakresie ich użytkowania.
  • czas pomiędzy zakończeniem procesu sterylizacji a inkubacją mieścił się w czasie ustalonym przez wytwórcę wskaźnika biologicznego lub był uzasadniony.
kontrola autoklawu
kontrola autoklawu

Charakterystyka wskaźników biologicznych stosowanych w kontroli procesu sterylizacji w autoklawie

Wskaźniki biologiczne zapewniają środki do bezpośredniej oceny bójczości mikrobiologicznej w procesie sterylizacji. W połączeniu z monitorowaniem fizycznym i/lub chemicznym procesu, wskaźniki biologiczne mogą dostarczyć wskazania skuteczności danego procesu sterylizacji. Testy biologiczne do autoklawu w najprostszej postaci składają się z zaszczepionego nośnika w opakowaniu pierwotnym. Zaszczepiony nośnik może przybierać różne formy, w tym paski papieru, nici, płytki metalowe lub inne nośniki odpowiednie do zaszczepienia. Opakowanie pierwotne jest wybierane tak, aby czynnik sterylizujący mógł przeniknąć do zaszczepionego nośnika, z utrzymaniem bariery sterylnej po przetwarzaniu.

Proces sterylizacji zaleca się uznać za zadowalający tylko wtedy, gdy osiągnięto zakładane parametry fizyczne i/lub chemiczne oraz wyniki mikrobiologiczne, określone przez odpowiedni program opracowywania,  walidacji i monitorowania procesu sterylizacji. Nieprawidłowości osiągnięcia oczekiwanych parametrów fizycznych i/lub chemicznych i/lub obciążenia mikrobiologicznego stanowią podstawę uznania procesu sterylizacji za niezgodny.

test biologiczny do autoklawu ampułkowy
test biologiczny do autoklawu ampułkowy

Zaleca się, aby podczas wykazywania skuteczności procesów sterylizacji wskaźniki biologiczne były stosowane w połączeniu z pomiarami fizycznymi i/lub chemicznymi. Gdy zmienna fizyczna i/lub chemiczna procesu sterylizacji jest poza jej określonymi wartościami granicznymi, zaleca się ocenić przyczynę niemożności osiągnięcia przez sterylizator jego parametrów procesu i problem skorygować. Podobnie, gdy występuje błąd wskaźnika, a fizyczne i/lub chemiczne zmienne procesu sterylizacji mieszczą się w określonych wartościach granicznych, zaleca się ocenić przyczynę braku inaktywacji wskaźnika podczas nieprawidłowości  w pracy sterylizatora i problem skorygować. Zaleca się ustalić systemy i/lub procedury w celu oceny wszelkich odchyleń od wartości granicznych cyklu procesu, a powody akceptacji wszelkich odchyleń zaleca się w pełni udokumentować.

Testy biologiczne składają się z określonej populacji organizmów testowych przedstawionych w taki sposób, aby umożliwić ich odzysk po procesie sterylizacji. Na przykład organizmy testowe wykorzystywane w procesach sterylizacji tlenkiem etylenu mogą być sporami odpowiedniego szczepu Bacillus subtilis lub Bacillus atrophaeus, jak podano w ISO 11138-2. Do sterylizacji parą wodną lub sterylizacji ciepłem wilgotnym, stosowane organizmy testowe mogą być sporami odpowiedniego szczepu Geobacillus stearothermophilus, jak podano w ISO 11138-3. Można zastosować organizmy testowe inne niż spory bakterii, jeżeli wykazano, że zapewniają odpowiednią oporność na proces sterylizacji.

Podstawą wszystkich wzorów stosowanych do określania charakterystyk oporności wskaźnika biologicznego, takich jak wartości D, jest to, że reakcja inaktywacji zachodzi według kinetyki logarytmicznoliniowej  pierwszego rzędu,  z wymaganiem, że wartość współczynnika determinacji, r2, dla liniowej krzywej przeżycia nie może być mniejsza niż 0,8 (patrz Załączniki E i F). Szczep organizmu testowego, metoda produkcji, płyn do zawieszania, nośnik i materiały opakowaniowe oraz warunki badania, wpływają na charakterystyki oporności wskaźników biologicznych (patrz ISO 11138-1).

Projekt i konstrukcja testu biologicznego mogą dawać unikalne charakterystyki oporności i mogą się różnić w zależności od tego, czy wskaźnik biologiczny jest przeznaczony do użycia w opracowywaniu i walidacji procesu sterylizacji, czy też w rutynowym monitorowaniu. Jeżeli projekt wskaźnika biologicznego do użycia w rutynowym monitorowaniu różni się od tego zastosowanego do walidacji procesów sterylizacji, obciążenie dla procesu podczas walidacji zaleca się skorelować z obciążeniem dla procesu podczas rutynowego monitorowania.

W zależności od umieszczenia we wsadzie i od określonych warunków procesu sterylizacji w tych konkretnych miejscach, wskaźniki biologiczne z tej samej serii mogą wykazywać różne zdolności przeżycia. Zaleca się, aby użytkownicy wskaźników biologicznych zwrócili uwagę, że 10 wskaźników rozmieszczonych w całym wsadzie nie uważa się za powtórzenia ze względu na różnice w bójczości, które mogą istnieć w całej komorze i wsadzie.

 

Zawiesina organizmu testowego do bezpośredniego zaszczepiania produktów

Bezpośrednie zaszczepienie organizmów testowych na lub w produkcie może być konieczne podczas opracowywania procesu i w innych badaniach, jeśli nie jest możliwe zastosowanie wskaźnika biologicznego. Bezpośrednie zaszczepienie może być odpowiednie do oceny takich czynników, jak zdolność produktu do sterylizacji, identyfikacja najtrudniejszych do sterylizacji miejsc w urządzeniu oraz zlokalizowane wpływy mikrobiologiczne, np. środowisko ciepła wilgotnego w porównaniu ze środowiskiem ciepła suchego.

Uzasadnienie wyboru miejsca (miejsc) „najtrudniejszego(-ych) do sterylizacji” na produkcie lub w obrębie wsadu sterylizacyjnego zaleca się udokumentować na podstawie danych doświadczalnych lub na podstawie wcześniejszej wiedzy dotyczącej określonej metodologii sterylizacji. W praktyce miejsce „najtrudniejsze do sterylizacji” przedstawia te miejsca, które najprawdopodobniej zapewnią wysoką oporność na proces sterylizacji. W celu zaznajomienia się z wytycznymi dotyczącymi określania i wyboru miejsc trudnych do sterylizacji zaleca się odnieść do szczegółowych norm dotyczących sterylizacji.

W celu oceny skuteczności sterylizacji w określonym położeniu lub miejscu na produkcie, przeznaczone gatunki i populacje organizmów testowych można zaszczepić w tych miejscach. Stosowanie zawiesin organizmów testowych do przygotowania zaszczepionych nośników lub zaszczepionych produktów wymaga ostrożności. Wynika to z faktu, że materiały, na które zaszczepiono organizmy testowe, mogą zmienić charakterystyki oporności tych organizmów. Oporność może być wyższa lub niższa ze względu na osadzanie jednowarstwowe lub wielowarstwowe (zlepianie), efekty powlekania i/lub bakteriostatyczne lub bakteriobójcze działanie materiału.

wskaźniki biologiczne Geobacillus stearothermophilus
wskaźniki biologiczne Geobacillus stearothermophilus

Wskaźniki biologiczne – zaszczepione nośniki

Zaszczepione nośniki składają się z określonej populacji organizmów testowych zaszczepionych na lub w odpowiednim materiale nośnika. Zaleca się zachować ostrożność, aby zapewnić, że wybrany materiał nośnika jest w stanie wytrzymać proces sterylizacji bez niepożądanego wpływu na jego charakterystyki działania i aby zminimalizować stratę zaszczepionych organizmów testowych podczas transportu i postępowania.

Charakterystyki oporności organizmu testowego w zawiesinie można znacznie zmienić po umieszczeniu na lub w nośnikach. Na charakterystyki oporności może wpływać kilka czynników, takich jak powierzchnia, na którą zaszczepia się zawiesinę (np. materiały stałe, produkty lepkie lub płyny), sposób, w jaki spory są rozkładane lub poddawane innemu postępowaniu, metody suszenia itp.

Jeżeli zaszczepiony nośnik usunięto z opakowania pierwotnego wskaźnika biologicznego lub dodatkowe opakowanie zostało umieszczone na opakowaniu pierwotnym w celu badań opracowywania i walidacji cyklu lub dla przyrządu testowego procesu (PCD) używanego do rutynowego monitorowania procesu, to użytkownik jest odpowiedzialny za podanie uzasadnienia tego zastosowania. Zaleca się wziąć pod uwagę, że oporność drobnoustroju na zaszczepionym nośniku może być inna od oporności podanej na oznakowaniu opakowanego wskaźnika biologicznego.

Charakterystyki oporności zaszczepionego nośnika podane przez wytwórcę wskaźników biologicznych mogą nie odpowiadać charakterystykom oporności ustalonym w bezpośrednich badaniach zaszczepiania produktu.

Zaleca się, aby materiał nośnika był oceniony przez wytwórcę wskaźnika biologicznego lub użytkownika w celu ustalenia, czy czynnik sterylizujący, do którego wskaźnik biologiczny jest przeznaczony, nie zatrzymuje ani nie uwalnia substancji hamujących (np. pozostałości czynnika sterylizującego), w takim stopniu, że odzysk niskiej liczby jest utrudniony.

Kontrola sterylizacji – zamknięte systemy wskaźników biologicznych

Zamknięte systemy wskaźników biologicznych składają się z:

  1. Ampułka zawierająca podłoże wzrostowe i nośnik zaszczepiony organizmami testowymi zawartymi w zewnętrznej fiolce, aby czynnik sterylizujący uzyskał dostęp do zaszczepionego nośnika przez barierę sterylną lub krętą ścieżkę.

Po ekspozycji na proces sterylizacji doprowadza się do kontaktu podłoża wzrostowego z zaszczepionym nośnikiem przez rozbicie ampułki podłoża wzrostowego, eliminując w ten sposób potrzebę aseptycznego przeniesienia zaszczepionego nośnika do oddzielnej fiolki podłoża wzrostowego. Zaleca się postępować zgodnie z zaleceniami wytwórcy wskaźnika biologicznego dotyczącymi inkubacji zamkniętych systemów wskaźników biologicznych. Ze względu na małą objętość i możliwość odparowania podłoża wzrostowego, przedłużenie inkubacji po ekspozycji może być niemożliwe.

Pozostałości substancji chemicznych pochodzące z procesów, takie jak tlenek etylenu lub pary nadtlenku wodoru, mogą hamować wzrost organizmów, które przeżyły. Zaleca się postępować zgodnie z zaleceniami wytwórcy wskaźnika biologicznego, dotyczącymi właściwego postępowania ze wskaźnikami biologicznymi przed inkubacją.

  1. Hermetycznie zamknięta ampułka zawierająca zawiesinę organizmów testowych w podłożu wzrostowym.

Są to tak zwane wskaźniki biologiczne w zamkniętej ampułce. Po ekspozycji na proces zamkniętą ampułkę inkubuje się w stanie nienaruszonym i nie jest wymagane przenoszenie aseptyczne. Ten typ wskaźnika jest wrażliwy tylko na temperaturę ekspozycji i czas oraz jest stosowany przede wszystkim do monitorowania sterylizacji ciepłem wilgotnym płynów wodnych.

Zamknięte systemy wskaźników biologicznych są na ogół większe niż wskaźniki biologiczne, które składają się tylko z zaszczepionego nośnika w opakowaniu pierwotnym i mogą nie pasować do miejsc w obrębie produktu, które przedstawiają miejsce największego utrudnienia procesu (PCL). Jeśli wskaźnik biologiczny nie może zostać umieszczony we wsadzie bez jego deformacji lub innego sposobu potencjalnie naruszającego jego opakowanie pierwotne, to zaleca się zastosować inny wskaźnik biologiczny. Ponadto zaleca się, aby użytkownik zdawał sobie sprawę, że deklarowane charakterystyki oporności mogą zależeć od metody usuwania powietrza stosowanej w cyklu sterylizacji.

testy biologiczne do autoklawu
testy biologiczne do autoklawu

Testy biologiczne w opracowywaniu procesu

W celu uzyskania dodatkowych informacji na temat opracowywania procesu, odnieść się do norm dotyczących sterylizacji dla tych procesów.

Gdy do opracowywania procesu stosuje się test biologiczny, zaleca się określić jego odpowiedniość.

Procesy sterylizacji różnią się znacznie pod względem charakterystyk działania i rodzaju sterylizowanych produktów. Chociaż każde zastosowanie jest unikalne, akceptowalne jest grupowanie podobnych produktów w tej samej rodzinie produktów w celu opracowywania, walidacji i rutynowego monitorowania procesu sterylizacji. Zaleca się dokładnie rozważyć te aspekty projektowania produktu lub opakowania, które mogą stanowić dodatkowe obciążenie dla procesu sterylizacji. Testy biologiczne można wykorzystać do określenia tych miejsc na produkcie, które stanowią szczególne obciążenie dla procesu, a także do ustalenia zakresu, w jakim różne rodzaje produktu są powiązane w odniesieniu do obciążenia występującego w procesie sterylizacji. Może to prowadzić do wyboru konkretnej konfiguracji produktu do dalszej analizy.

Zaleca się stosować wskaźniki biologiczne w połączeniu z odpowiednimi fizycznymi i/lub chemicznymi pomiarami parametrów procesu w celu wykazania skuteczności procesu sterylizacji.

Nie jest możliwe podanie ogólnych wskazówek dotyczących liczby wskaźników biologicznych na objętość sterylizatora, ponieważ zależy to od odtwarzalności cykli, a także od ewentualnych różnic parametrów procesu w całym wsadzie podczas sterylizacji. Jednak inne normy dotyczące sterylizacji mogą dostarczyć wytycznych na temat zalecanej liczby wskaźników biologicznych, które trzeba zastosować. Prawidłową liczbę wskaźników biologicznych do użycia można ustalić na podstawie danych zebranych z użycia wskaźników biologicznych i/lub badań zanieczyszczenia mikrobiologicznego, a także na podstawie dokumentacji dotyczącej rozkładu czynnika sterylizującego w całym wsadzie.

Wdrożenie metody połączenia wskaźnik biologiczny/zanieczyszczenie mikrobiologiczne wymaga rozważenia wielu takich samych czynników, w odniesieniu do umiejscowienia wskaźnika biologicznego w tych miejscach w produkcie i wsadzie, które stanowią szczególne obciążenie dla procesu sterylizacji. Metodę stosuje się tylko wtedy, gdy dane są wystarczające do poddania ich ważnej analizie statystycznej i istnieje wysoki poziom ufności, że dane dotyczące zanieczyszczenia mikrobiologicznego są reprezentatywne dla warunków „najgorszego przypadku”. Istnieje wiele przyczyn zmienności, takich jak surowce, kontrola procesu i zmiany sezonowe. Zaleca się wziąć pod uwagę obecność i charakter rozkładu zanieczyszczenia mikrobiologicznego w produkcie. Ponieważ rozkład zanieczyszczenia mikrobiologicznego w produkcie może się znacznie różnić, ważne jest ustalenie, w jaki sposób ten rozkład może wpływać na obciążenie, jakie produkt przedstawia w procesie sterylizacji, a tym samym wpływa na wybór wskaźnika biologicznego.

Określenie zanieczyszczenia mikrobiologicznego produktu oraz jego rodzaju i rozkładu oporności wymaga uwzględnienia czynników omówionych w normie wieloczęściowej ISO 11737. Zaleca się, aby wybrana metoda została zwalidowana zgodnie z wymaganiami tych norm oraz zaleca się ustalić statystyczny przedział ufności oszacowania zanieczyszczenia mikrobiologicznego.

Podejście nadzabicia w stosowaniu wskaźników biologicznych

Ta metoda jest często określana jako „metoda połowy cyklu” lub „metoda sterylizacji nadzabicia” i jest omówiona w ISO 14937. Metoda ta opiera się na założeniach, że:

  1. wskaźnik biologiczny (drobnoustrój wzorcowy) stanowi większe obciążenie niż zanieczyszczenie mikrobiologiczne;
  2. proces pełnej sterylizacji osiąga SAL co najmniej 10–6;
  3. w połowie cyklu użytkownik może zazwyczaj wykazać zmniejszenie o co najmniej 6 log.

Norma wieloczęściowa ISO 11138 dopuszcza charakterystyki oporności inne niż minimum wymagane do celów rutynowego monitorowania.

Te kryteria nadzabicia można uwzględnić przez umieszczenie wskaźników biologicznych lub zaszczepionych nośników, na przykład populacją organizmów testowych 106, spełniającą minimalne wymagania dotyczące oporności na PCL(y) w produkcie, w obrębie całego wsadu. Zaleca się wcześniej wykazać, że te miejsca  w obrębie wsadu stanowią obciążenie dla procesu sterylizacji i korelują z miejscami „najtrudniejszymi do sterylizacji”, a wybranie tych miejsc zapewni odpowiednią redukcję log dla całego wsadu produktu. Zaleca się wykazać redukcję w populacji organizmów o co najmniej 6 log w ciągu połowy normalnego czasu utrzymania lub dawki procesu sterylizacji, który ma być zwalidowany, gdy wszystkie wskaźniki biologiczne są statystycznie równoważnymi próbkami. Procent wskaźników biologicznych wykazujących wzrost może być skorelowany z uzyskaną redukcją log. Jeśli badanie w warunkach połowy cyklu wykazuje zmniejszenie w populacji organizmów testowych o ponad sześć log, możliwe jest, że nie nastąpi wzrost organizmu testowego, w zależności od wielkości próbki. Umieszczenie wskaźnika biologicznego w produkcie lub we wsadzie  prawdopodobnie zmieni jego widoczne charakterystyki oporności w porównaniu z opornością podaną na oznakowaniu wskaźnika biologicznego. Może to wymagać dostosowania okresu ekspozycji połowy cyklu, aby skompensować dodatkową oporność spowodowaną umieszczeniem wskaźnika biologicznego w produkcie lub wsadzie. Podobne dostosowania mogą być potrzebne, gdy do przygotowania zaszczepionego produktu stosuje się zawiesiny organizmu testowego.

Zaleca się zastosować odpowiednie pomiary fizyczne w celu ustalenia miejsc największego utrudnienia procesu w całym wsadzie, co może pomóc w określeniu miejsc umieszczenia wskaźników biologicznych. Zaleca się przygotować wystarczającą liczbę sond ze wskaźnikami biologicznymi umieszczonymi w uprzednio ustalonym miejscu w produkcie.

W przypadku sterylizacji ciepłem wilgotnym, wartość z wskaźnika biologicznego może różnić się od wartości z dla 10 °C, którą zwykle przyjmuje się za bójczość procesu na podstawie pomiarów temperatury. Może to prowadzić do rozbieżności między bójczością procesu zintegrowanego, określoną za pomocą wskaźników biologicznych a bójczością określoną przez bezpośrednie pomiary temperatury.

Metoda połączenia wskaźnika biologicznego i zanieczyszczenia mikrobiologicznego

Metoda połączenia wskaźnika biologicznego i zanieczyszczenia mikrobiologicznego wymaga poznania oporności populacji i drobnoustroju zanieczyszczenia mikrobiologicznego produktu. Metoda ta ma tę zaletę, że pozwala na skrócenie okresu w cyklu ekspozycji i minimalizuje ekspozycję produktu na czynnik sterylizujący, co omówiono w ISO 14937.

Metodologia połączenia wskaźnika biologicznego/zanieczyszczenia mikrobiologicznego wymaga wyboru warunków procesu zapewniających bójczość procesu wystarczającą do inaktywacji zanieczyszczenia mikrobiologicznego do poziomu zapewnienia sterylności (SAL) podanego na etykiecie produktu. Liczba powtórzeń cyklu, wymagana do wykazania odpowiedniej skuteczności, będzie zależeć od pewności co do dokładności i stopnia powtarzalności inaktywacji zanieczyszczenia mikrobiologicznego, określonej podczas oszacowania zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Ponieważ zanieczyszczenie mikrobiologiczne ma zwykle mniejszą oporność na czynnik sterylizujący niż wskaźnik biologiczny, pożądany SAL można zwykle osiągnąć przy mniejszym zakresie postępowania niż byłoby to zalecane w przypadku stosowania metody nadzabicia. Zakres wymaganego postępowania zależy od związku między wskaźnikiem biologicznym a zanieczyszczeniem mikrobiologicznym w stosunku do populacji i oporności na czynnik sterylizujący.

W tej procedurze można zastosować odpowiedni wskaźnik biologiczny z populacją organizmu testowego mniejszą niż 106 CFU[1] (jednostek tworzących kolonie) na nośnik, o ile można wykazać pożądany SAL. Zaleca się wziąć pod uwagę zmienność zanieczyszczenia mikrobiologicznego podczas określania minimalnej populacji wskaźnika biologicznego, która zalecana była do walidacji procesu sterylizacji. Zaleca się, aby populacja wskaźnika biologicznego była nie mniejsza niż 103 organizmów testowych na nośnik.

Procedury oceny zanieczyszczenia mikrobiologicznego produktu zostały omówione w ISO 11737-1. Ze względu na zmienność zanieczyszczenia mikrobiologicznego może być konieczne scharakteryzowanie zanieczyszczenia mikrobiologicznego i oporności rutynowo występującego zanieczyszczenia mikrobiologicznego.

Badania oporności całej populacji zanieczyszczenia mikrobiologicznego mogą być wymagane w celu zapewnienia, że podane obciążenie jest mniejsze niż w przypadku wskaźnika biologicznego. Jedną z możliwych metod oznaczania może być przeprowadzenie subletalnych cykli sterylizacji w celu oznaczenia, że populacja zanieczyszczenia mikrobiologicznego nie przeżyje tak dużej ekspozycji jak wskaźnik biologiczny.

Podstawowe kryterium metodologii połączenia wskaźnika biologicznego/zanieczyszczenia mikrobiologicznego wymaga wyboru warunków przetwarzania, które zmniejszają populację zanieczyszczenia mikrobiologicznego do 100. W okresie utrzymania zaleca się zastosowanie dodatkowego czynnika bezpieczeństwa, zgodnego z podanym na oznakowaniu produktu (patrz Rysunek A.1). Liczba powtórzeń cykli, dla których zaleca się to wykazać podczas opracowywania cyklu sterylizacji, zależy od dokładności i granic przedziału ufności szacowania zanieczyszczenia mikrobiologicznego.

Szczepy drobnoustrojów, których oporność jest większa niż całkowita oporność zanieczyszczenia mikrobiologicznego produktu, mogą być wykorzystane jako wskaźniki biologiczne, jeżeli ich kinetyka sterylizacji spełnia kryteria dla wskaźnika biologicznego (logarytmiczno-liniowa krzywa zabicia ze współczynnikiem determinacji 0,8). Jednak te organizmy wskaźnika mogą być mniej oporne na proces niż te określone w normie wieloczęściowej ISO 11138.

Jeśli oporność zanieczyszczenia mikrobiologicznego jest większa niż w przypadku dostępnych w handlu wskaźników biologicznych, zaleca się rozważyć włączenie do badań opracowywania procesu szczepów opornych, wyizolowanych z zanieczyszczenia mikrobiologicznego (patrz ISO 11135  i ISO 17665-1). Alternatywnie, zaleca się zwiększyć okres utrzymania lub dawkę o współczynnik określony przez względną oporność zanieczyszczenia mikrobiologicznego albo można zastosować wskaźnik biologiczny lub wskaźnik biologiczny z większą populacją stanowiącą obciążenie większe lub równe szczepom opornym.

autoklaw sterylizacja
autoklaw sterylizacja

Metoda zanieczyszczenia mikrobiologicznego

Zaleca się odniesienie do normy wieloczęściowej ISO 11737 w zakresie metod mikrobiologicznych odpowiednich do oszacowania zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Niektóre drobnoustroje zanieczyszczenia mikrobiologicznego mogą mieć większą oporność niż testy biologiczne opisane w normie wieloczęściowej ISO 11138. Drobnoustroje zanieczyszczenia mikrobiologicznego o większej oporności można zastosować jako modelowy wskaźnik biologiczny. Metodę tę omówiono w ISO 14937.

Informacje dotyczące walidacji i rutynowego monitorowania oraz zastosowania metod całkowitych zanieczyszczeń mikrobiologicznych podano w odpowiednich Normach Międzynarodowych dotyczących konkretnego procesu sterylizacji. Szczegółowe specyfikacje metody całkowitego zanieczyszczenia mikrobiologicznego, bez odniesienia do wskaźników biologicznych, podano w normie wieloczęściowej ISO 11737.

Wskaźniki biologiczne w walidacji sterylizacji

Jeśli wskaźniki biologiczne są wykorzystywane w procesie walidacji, zaleca się również wziąć pod uwagę typ (typy) wskaźnika(-ów) biologicznego(-ych), który(-e) można wykorzystać w rutynowym monitorowaniu. Różne wskaźniki biologiczne mogą stanowić różne stopnie obciążenia dla procesu sterylizacji. Jeżeli do walidacji i rutynowego monitorowania stosowane są różne wskaźniki biologiczne, to zaleca się w badaniach walidacyjnych uwzględnić obydwa, aby można było ustalić i udokumentować związek między ich opornościami.

Walidacja procesu sterylizacji wymaga dokumentacji, że proces jest w stanie konsekwentnie wytwarzać produkt, który spełnia wcześniej określone specyfikacje.

Umieszczenie wskaźników biologicznych i postępowanie z nimi

Zaleca się udokumentować liczbę wskaźników biologicznych w produktach i/lub wsadach produktów.

Zaleca się, aby użytkownik udokumentował umieszczenie wybranych wskaźników biologicznych w komorze sterylizatora, w obrębie wsadu produktu. Innymi kwestiami do uwzględnienia podczas umieszczania wskaźnika biologicznego w obrębie wsadu produktu są wzorce załadunku, gęstość wsadu i geometria, PCL, rozmieszczenie fizycznych i/lub chemicznych czujników lub sond, potencjalne rozwarstwienie elementów fizycznych, wpływ opakowania itp.

Zaleca się usunąć wskaźniki biologiczne ze wsadu sterylizatora najszybciej jak to możliwe po zakończeniu procesu, bez narażania bezpieczeństwa personelu. Zaleca się badać je w określonym odstępie czasu, ustalonym dla tego produktu i procesu. Zaleca się uzasadnić odstępy czasu między przygotowaniem wskaźników a ich wykorzystaniem w procesie sterylizacji oraz między końcem procesu a hodowlą wskaźników, w celu wykazania, że odstępy te nie mają wpływu na wyniki badań biologicznych sterylizatora lub procesu sterylizacji. Nie zaleca się przekraczać tych uzasadnionych odstępów czasu. Jeśli ze wskaźnikami biologicznymi postępuje się w inny sposób niż określony przez wytwórcę, to zaleca się zwalidować procedury w celu ustalenia, czy wpływają one na działanie wskaźnika biologicznego. Zaleca się przestrzegać ustalonych odstępów czasu.

Przy usuwaniu testów biologicznych ze sterylizatora zaleca się przestrzegać odpowiednich wymagań dotyczących bezpieczeństwa pracowników.

Kwalifikacja sterylizatora

IQ i OQ są przeprowadzane w celu uzyskania i udokumentowania dowodów, że sterylizator, jego   media i wyposażenie pomocnicze zostały dostarczone i zainstalowane zgodnie ze specyfikacjami oraz że sterylizator działa w  zakresie wcześniej ustalonych wartości granicznych, jeśli jest obsługiwany zgodnie z instrukcjami (patrz ISO 11135, ISO 17665-1 i ISO 20857).

Wskaźniki biologiczne mogą być stosowane w OQ/PQ, na przykład, w celu ustalenia dowodów na jednorodność dystrybucji czynników sterylizujących.

Wytwórcy sterylizatorów mogą przeprowadzić badania typu przy użyciu testów biologicznych dla określonych rodzajów wsadów.

 

Kwalifikacja procesowa

Po zakończeniu kwalifikacji sterylizatora przeprowadzane jest badanie kwalifikacji procesowej (PQ) w celu udokumentowania odtwarzalności i skuteczności procesu sterylizacji, w tym jego zdolności do wytwarzania produktu spełniającego określone wcześniej specyfikacje jakości. Walidacja ustala zgodność procesu z wcześniej określonymi specyfikacjami; można zastosować odpowiednie Normy Międzynarodowe, takie jak ISO 11135, ISO 14937, ISO 17665-1 i ISO 20857. Różne wskaźniki biologiczne mogą zapewniać różne stopnie obciążenia dla procesu sterylizacji. Zaleca się ustalić i udokumentować korelację między wskaźnikami biologicznymi stosowanymi do opracowywania i walidacji cyklu a stosowanymi do rutynowego monitorowania.

 

Przegląd i zatwierdzenie walidacji

Po pomyślnym zakończeniu kwalifikacji, przed rozpoczęciem wytwarzania, konieczny jest przegląd dokumentacji walidacyjnej, w tym działanie wskaźnika biologicznego, w celu sprawdzenia, czy proces jest zgodny z wymaganiami.

 

Ponowna kwalifikacja z wykorzystaniem wskaźników biologicznych

Podczas przeprowadzania ponownej kwalifikacji, zaleca się stosować te same charakterystyki oporności, liczbę wskaźników biologicznych, ich umieszczenie we wsadzie produktu itp. Jeśli do procesu kwalifikuje się nowy wskaźnik biologiczny, ważne jest ustalenie i udokumentowanie korelacji między nowym wskaźnikiem biologicznym a poprzednim wskaźnikiem biologicznym.

W przypadku stosowania procesów sterylizacji ciepłem wilgotnym lub tlenkiem etylenu zaleca się stosować ISO 17665-1 lub ISO 11135.

Zaleca się ustalić minimalną częstość oceny charakterystyk oporności serii wskaźnika biologicznego. Rozważania prowadzące do różnych przedziałów czasowych w ponownej kwalifikacji systemu wskaźnika biologicznego mogą obejmować zmiany sezonowe, zmiany produktu i materiału, a także zmiany wyposażenia itp. Jeżeli charakterystyki oporności wskaźnika biologicznego zmienią się poza wcześniej ustalone wartości graniczne, to zaleca się przeprowadzić ponowną kwalifikację. W przypadku zmiany podłoża do odzysku, nowego podłoża wzrostowego zaleca się skorelować z poprzednio zastosowanymi, a wybór nowego podłoża wzrostowego zaleca się zwalidować.

W przypadku wskaźników biologicznych zakupionych od zakwalifikowanego dostawcy, można oczekiwać, że charakterystyki oporności mieszczą się w oczekiwanej tolerancji (patrz ISO 11138-1) przez cały okres trwałości określony na oznakowaniu, jeśli są przechowywane zgodnie z zaleceniami na oznakowaniu.

 

Wskaźniki biologiczne w rutynowym monitorowaniu

Testy biologiczne zapewniają metodę wykazania bójczości mikrobiologicznej w procesie sterylizacji; jednak w celu ilościowego określenia bójczości może być wymagane przeprowadzenie podczas walidacji  części procesu (np. połowy cyklu). W przypadku dobrze opracowanych, zwalidowanych procesów możliwe jest zwalnianie parametryczne (np. tlenek etylenu, patrz ISO 11135 lub ciepło suche, patrz ISO 20857), jednak lokalne wymagania regulacyjne mogą również wymagać zastosowania wskaźników biologicznych jako części monitorowania procesu i zwalniania serii. W przypadku procesów, w których nie jest możliwy wiarygodny pomiar zmiennych procesu, a zatem parametryczne zwalnianie serii nie jest możliwe, wskaźniki biologiczne stanowią najlepszą dostępną alternatywę dla wykazania bójczości mikrobiologicznej w procesie sterylizacji. Patrz ISO 11135 dla tlenku etylenu i ISO 20857 dla ciepła suchego.

Zaleca się, aby typ wskaźnika biologicznego i jego umiejscowienie w produkcie lub wsadzie produktu było zgodne z miejscami wsadu produktu, które określono podczas opracowywania lub walidacji procesu sterylizacji. Jeżeli  system obciążenia mikrobiologicznego stosowany do rutynowego monitorowania procesu sterylizacji różni się od stosowanego w walidacji procesu, zaleca się udokumentować związek między systemem do walidacji a systemem do rutynowego monitorowania.

Zaleca się uzasadnić określone odstępy czasu między przygotowaniem wskaźników a sterylizacją oraz między zakończeniem procesu a hodowlą wskaźników, w celu wykazania, że odstępy te nie mają wpływu na działanie wskaźnika biologicznego.

Wskaźniki biologiczne do rutynowego monitorowania stosowane w metodzie połączenia wskaźnik biologiczny/zanieczyszczenie mikrobiologiczne nie będą zgodne ze wszystkimi częściami normy wieloczęściowej ISO 11138, jeżeli populacja i/lub oporność jest niższa niż minimalne wymagania w odpowiedniej części.

 

Umieszczenie wskaźników biologicznych i postępowanie z nimi

Podczas opracowywania cyklu i walidacji wskaźniki biologiczne są umieszczane w tych miejscach w produkcie i wsadzie, które stanowią szczególne obciążenie dla procesu sterylizacji. Podczas rutynowego monitorowania pożądane może być umieszczenie testów biologicznych w bardziej dostępnych miejscach za pomocą PCD. W takich sytuacjach, umiejscowienie wskaźników biologicznych zaleca się skorelować z miejscami zastosowanymi podczas opracowywania cyklu lub walidacji, aby zapewnić, że integralność procesu sterylizacji nie została naruszona. Zaleca się również zapewnić jednakowe umieszczanie wskaźników biologicznych wykorzystywanych do rutynowego monitorowania. Zaleca się przestrzegać wskazań dostawcy wskaźnika biologicznego w odniesieniu do właściwego postępowania ze wskaźnikiem biologicznym po sterylizacji. Z reguły zaleca się usunięcie wskaźników biologicznych ze wsadu bez narażania bezpieczeństwa personelu oraz w określonym czasie, który jest uzasadniony. Zaleca się następnie przenieść je aseptycznie do właściwego podłoża wzrostowego w określonym czasie i inkubować w odpowiednich temperaturach. Jeżeli stosuje się zamknięte systemy wskaźników biologicznych, to eliminuje się potrzebę aseptycznego postępowania.

Oprócz wymagań kwalifikacyjnych dotyczących właściwości podłoża wzrostowego i żywotności wskaźnika biologicznego, użytkownik może również wykonywać skrócone wersje tych sprawdzeń podczas  rutynowego monitorowania procesu sterylizacji. Na przykład użycie nieprzetworzonego wskaźnika biologicznego inkubowanego w podłożu wzrostowym wskazuje zarówno na żywotność wskaźnika, jak i odpowiedniość warunków wzrostu.

W krajowych dokumentach zawierających wytyczne może być wymagane użycie wskaźników kontrolnych  niepoddanych ekspozycji.

Zaleca proces za możliwy do zaakceptowania tylko wtedy, gdy dokonano przeglądu pożądanych parametrów fizycznych i/lub chemicznych oraz zinterpretowano wyniki mikrobiologiczne i stwierdzono, że oba są zgodne z pożądanymi kryteriami.

PCD w połączeniu ze wskaźnikami biologicznymi można stosować zarówno do walidacji, jak i rutynowego monitorowania cykli sterylizacji. PCD są zaprojektowane tak, aby umieszczenie wskaźnika biologicznego w PCD stanowiło miejsce, które uważa się za przedstawiające odpowiednio największe obciążenie dla procesu. Projekt PCD może się różnić w zależności od charakteru produktu, który będzie obciążeniem.

PCD zaleca się zaprojektować z uwzględnieniem różnych parametrów procesu, które wpływają na proces sterylizacji. Skład PCD zależy od rodzaju monitorowanego cyklu, a także od rodzaju produktu przeznaczonego do sterylizacji. Przykłady przyrządów testowych procesu można znaleźć w normach krajowych, takich jak ANSI/AAMI ST79 (sterylizacja parą wodną), EN 285 (sterylizatory parowe), EN 1422 (sterylizatory na tlenek etylenu EO).

PCD mogą być dostępne w handlu jako zestawy prefabrykowane, często nazywane „zestawami badań biologicznych”. Zaleca się, aby PCD i ich umieszczenie we wsadzie produktu przedstawiały obciążenie dla procesu, które jest równoważne lub większe niż obciążenie przedstawiane przez wsad produktu.

 

Interpretacja i kryteria akceptacji dla testów z wykorzystaniem wskaźników biologicznych

Zaleca się, aby kryteria akceptacji procesu sterylizacji uznanego za zadowalający były ustalane podczas opracowywania procesu sterylizacji, z zastosowaniem odpowiednich norm dotyczących walidacji i kontroli procesu sterylizacji. W celu uzyskania wiarygodnych wyników zaleca się ustalić i utrzymywać rutynowe procedury; zaleca się, aby procedury te były wykonywane przez przeszkolonych pracowników technicznych przy użyciu odpowiedniego wyposażenia.

 

Interpretacja wyników wskaźników biologicznych

Zaleca się, aby zwalidowany proces sterylizacji, w którym wszystkie wstępnie ustawione parametry zostały spełnione, nie wykazywał wzrostu wskaźnika biologicznego. Dodatni wskaźnik biologiczny może wynikać z  nieprawidłowości procesu sterylizacji, niewykrytego przez pomiary fizyczne lub chemiczne, co powoduje nieodpowiednią bójczość w stosunku do wybranego wskaźnika biologicznego.

Wszelkie wyniki badania wskaźnika biologicznego wykazujące wzrost wskaźnika, gdy oczekiwany jest brak wzrostu, mogą wskazywać na nieodpowiedni proces, wadliwy wskaźnik biologiczny, wadliwe badanie systemu lub błąd laboratorium/operatora i zaleca się, aby prowadziło to do dalszego wyjaśniania. Działania, które należy podjąć po wzroście wskaźnika biologicznego po procesie sterylizacji, mogą się różnić w zależności od  polityki danej instytucji oraz przepisów oraz mogą wymagać odrzucenia serii produktu jako niesterylnej. Zaleca się potwierdzić identyfikację wzrostu organizmu testowego oraz podjąć wysiłek w celu zidentyfikowania przyczyny wzrostu. Konsekwentny wzrost wskaźników biologicznych po procesie sterylizacji może wskazywać na proces sterylizacji, który nie został przeprowadzony zgodnie ze zwalidowanymi parametrami, nieodpowiedni proces sterylizacji lub prawdopodobnie spowodowany użyciem serii  wskaźnika biologicznego o wyjątkowo dużej oporności na czynnik sterylizujący. Jeśli wyjaśnianie wykaże, że proces sterylizacji został przeprowadzony odpowiednio i nie ma znaczącej zmiany we wskaźniku biologicznym, która wpłynęłaby na jego działanie w procesie sterylizacji, wówczas zaleca się powtórzyć proces sterylizacji. Do oznaczania braku wzrostu organizmu wskaźnika przydatne może być barwienie metodą Grama w połączeniu z morfologią kolonii i komórki lub metodami identyfikacji genetycznej.

Dany sterylizator, rodzaj produktu i załadunek produktu wpływają na proces sterylizacji. Zaleca się ustalić charakterystyki oporności wskaźnika biologicznego stosowanego w procesie, aby cały system był skuteczny. Akceptowalne dane ze wskaźnika biologicznego są tylko częścią danych niezbędnych do wykazania, że proces sterylizacji zakończył się powodzeniem. Hodowle wykazujące wzrost, który nie został potwierdzony jako organizm wskaźnika, zaleca się dalej sprawdzać w celu ustalenia przyczyny pozytywnego wzrostu. Częste zanieczyszczenia w badaniu mogą wskazywać na wadliwy system badania lub nieodpowiednie szkolenie personelu.

 

Zastosowanie wzorcowych wskaźników biologicznych

Ogólna ocena działania wskaźnika biologicznego przez użytkownika

Dwie główne charakterystyki wskaźnika biologicznego, to nominalna populacja drobnoustrojów i oporność wskaźnika biologicznego na proces sterylizacji, wyrażone jako wartość D.

Wskaźnik biologiczny zaleca się transportować, przechowywać i postępować z nim tak, aby zapewnić utrzymanie nominalnej populacji i charakterystyk oporności podczas okresu przechowywania. Sterylizacja podłoża hodowlanego, warunki inkubacji, konserwacja  wyposażenia do badania i szkolenie personelu laboratoryjnego, to niektóre obszary, które zaleca się zdefiniować i kontrolować, aby zapewnić odpowiednie działanie wskaźnika biologicznego. Użytkownik może okresowo sprawdzać populację wskaźnika biologicznego. Jeśli wyżej wymienione obszary są kontrolowane i zwalidowane, to może nie być konieczne rutynowe badanie wskaźnika biologicznego przez użytkownika. Zaleca się, aby użytkownik odnotowywał wszelkie odchylenia od zastosowanego procesu i zestawu referencyjnego parametrów, które zostały zdefiniowane dla procesu. Jeśli parametry cyklu sterylizatora lub wsadu są przyczyną odchyleń w charakterystykach oporności wskaźnika biologicznego, to zaleca się, aby użytkownik zbadał możliwość wyeliminowania tych zmian i dokonał ponownej kwalifikacji procesu.

Zmiany w działaniu rezystometru mogą w niektórych przypadkach dać różne wyniki charakterystyk oporności dla wskaźnika. W takich przypadkach zaleca się, aby wytwórca na żądanie udzielił informacji o szczegółach odpowiednich warunków badania.

Jeżeli użytkownik ustali dane dotyczące liczby populacji nominalnej lub wartości D i są one poza wartościami granicznymi wymaganymi przez odpowiednie normy lub poza informacjami na oznakowaniu, zachęca się użytkownika do szukania informacji u wytwórcy, aby upewnić się, że do uzyskania danych zastosowano te same techniki, metody i warunki.

 

Populacja nominalna organizmu testowego

W ISO 11138-1 wymaga się od wytwórcy podawania nominalnej populacji organizmów testowych każdego testu biologicznego jako części informacji na etykiecie. W normach podano wymagania odnoszące się do minimalnej liczby drobnoustrojów na wskaźniku biologicznym lub zaszczepionym nośniku w celu zapewnienia minimalnej oporności wskaźnika. Zaleca się, aby podczas badania populacja wynosiła od 50 % do 300 % populacji nominalnej. Zaleca się, aby populacja BI oznaczona na oznakowaniu przez wytwórcę była używana we wszystkich obliczeniach po weryfikacji. W celu upewnienia się, że stosowane są te same techniki i procedury, zaleca się skonsultowanie z wytwórcą wskaźnika biologicznego, ponieważ zmiany procedur badania mogą wpływać na wyniki oznaczania populacji. W ISO 11138-1 wymaga się od wytwórcy dostarczenia tych informacji na prośbę.

Spory, takie jak Geobacillus stearothermophilus, mogą wymagać procedury szoku termicznego w celu uzyskania większej dokładności obliczeń. Zastosowano z powodzeniem kilka kombinacji temperatury i czasu. Na wyniki może mieć wpływ poddawanie działaniu mechanicznemu zaszczepionego nośnika, a zatem drobnoustrojów, podczas przygotowywania porcji. Różne praktyki laboratoryjne, a nawet różnice w działaniu poszczególnych pracowników mogą prowadzić do różnych wyników. Zaleca się, aby metoda usuwania spor z zaszczepionego nośnika była zwalidowana i może obejmować mechaniczny rozpad nośnika lub inne metody, takie jak ultradźwięki. Jeśli użytkownik zastosuje metodę inną niż zalecana przez wytwórcę, to zaleca się ją zwalidować.

Zaleca się, aby płyn do rozpadu nie wpływał na liczbę drobnoustrojów, które przeżyły (np. zaleca się, aby nie był podłożem wzrostowym) i zaleca się, aby w żaden inny sposób nie wpływał negatywnie na wynik z powodu wpływu hamującego wzrost drobnoustroju. Zaleca się wysterylizować płyn przed użyciem, a jego sterylność zwalidować.

Zaleca się, aby użytkownik postępował zgodnie z zalecanymi przez wytwórcę procedurami odzysku, aby zapewnić porównywalne wyniki. Zaleca się, aby wysterylizowany płyn i przetworzony, zaszczepiony nośnik były poddawane postępowaniu aseptycznemu, aby uniknąć jakiegokolwiek zanieczyszczenia mikrobiologicznego lub zanieczyszczenia krzyżowego, które mogłoby wpłynąć na wyniki. Zaleca się zwrócić uwagę na dokładność liczenia na płytkach. Dokładność liczenia na płytkach zależy od wielu czynników, w tym od rozcieńczenia i błędu pipetowania, kalibracji urządzeń pipetujących, szkolenia pracowników technicznych oraz liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) na płytkę. Ogólnie przyjmuje się, że zalecana liczba wynosi od 30 CFU do 300 CFU na płytkę, aby uzyskać największą dokładność statystyczną.

 

Określanie oporności drobnoustrojów stosowanych we wskaźnikach biologicznych

Jeśli użytkownik zdecyduje się zweryfikować deklaracje na oznakowaniu lub określić wartość D wskaźnika biologicznego w lub na sterylizowanym przedmiocie, to zaleca się, aby stosował te same warunki, co wytwórca. Obejmuje to zastosowanie określonych parametrów dla odpowiedniego rezystometru. Oporność wskaźnika biologicznego można oszacować lub obliczyć przy użyciu trzech podejść: metody krzywej przeżycia, metody frakcji ujemnej i obliczenia okna przeżycia-zabicia. Po ekspozycji na przyrostowe odstępy czasu procesu sterylizacji (tj. części czasu utrzymania) wskaźniki są badane metodą przedstawioną w a) do c). W normie wieloczęściowej ISO 11138 określono wymagania dla każdej metody, które można stosować w połączeniu, w celu oszacowania oporności.

Główne różnice między tymi trzema podejściami opisano w podpunktach od a) do c).

  1. Metoda krzywej przeżycia: Ta metoda wymaga liczenia kolonii. W zależności od typu zaszczepionego nośnika i właściwości drobnoustroju często oznacza to zastosowanie mechanicznej degradacji zaszczepionego nośnika (przeprowadzonej przy użyciu technik aseptycznych) z późniejszym pobraniem i liczeniem całkowitej możliwej do odzysku liczby CFU na stałym podłożu (np. odrębne kolonie na płytkach agarowych).
  2. Metoda frakcji ujemnej: Ta metoda wymaga określenia wzrostu/braku wzrostu i wykorzystuje aseptyczne przeniesienie nienaruszonego zaszczepionego nośnika do płynnego podłoża hodowlanego. Przenoszenie odbywa się bez wpływu mechanicznego, mikrobiologicznego lub termicznego na zaszczepiony nośnik.
  3. Charakterystyki odpowiedzi przeżycia-zabicia: Opiera się na metodzie frakcji ujemnej, dając niższe wartości graniczne, w których wszystkie próbki wykazują wzrost i górne wartości graniczne, w których żaden ze wskaźników nie wykazuje wzrostu po ekspozycji na cały proces sterylizacji lub po czasie tego procesu, lub w odstępach między dawkami procesu sterylizacji (patrz ISO 11138-1:2017, Załącznik E).

Zwykle podczas określania wartości D z dowolnej serii ekspozycji stosuje się uśrednianie wyników z zestawu próbek. Łączenie danych w ten sposób ma ograniczenia statystyczne. Dane można łączyć tylko wtedy, gdy próbki są statystycznie równoważne. Na przykład, jeśli 10 próbek jest rozłożonych w komorze sterylizacyjnej, to nie wszystkie są prawdziwie równoważne. Jednak wiele próbek skupionych w tym samym miejscu w komorze sterylizatora można uznać za prawdziwie równoważne (patrz EN 285 i pozycja bibliograficzna).

 

Metoda krzywej przeżycia

Ta metoda jest również określana jako „metoda bezpośredniego zliczania” i „metoda zliczania liczby”. Metoda ta wykorzystuje procedury bezpośredniego liczenia (patrz ISO 11138-1) i zaleca się, aby była przeprowadzana na zaszczepionych nośnikach.

 

Metoda frakcji ujemnej

W użyciu jest kilka takich metod, zwanych metodami frakcji ujemnej lub metodami kwantowymi. Wzrost lub brak wzrostu obserwuje się w stosunku do liczby organizmów poddanych ekspozycji.

W niniejszym dokumencie podano wspólną metodę odniesienia dla normy wieloczęściowej ISO 11138, którą jest Procedura Ograniczona Holcomba-Spearmana-Karbera (LHSKP). Dwie inne powszechnie stosowane metody statystyczne, Procedura Holcomba-Spearmana-Karbera (HSKP) i Procedura Stumba-Murphy`goCochrana (SMCP), mogą być stosowane w określonych warunkach (patrz Załącznik C).

  1. Procedura Ograniczona Holcomba-Spearmana-Karbera (LHSKP): Procedurę tę można zastosować, jeśli warunki kolejnych ekspozycji, takie jak czasy lub dawki, różnią się stałym odstępem czasowym i identyczna liczba powtórzeń jest poddawana ekspozycji dla każdego odstępu czasu ekspozycji. Na przykład ekspozycje mogą wynosić 3 min, 5 min, 7 min i 9 min, co odpowiada 2-minutowemu odstępowi czasu. W ISO 11138-1 określono co najmniej 20 powtórzeń dla każdego odstępu dla LHSKP. W niektórych procesach sterylizacji, takich jak ozonowanie, parametr krytyczny „czas” można zastąpić „dawką”.
  2. Procedura Holcomba-Spearmana-Karbera (HSKP): Ta metoda jest podobna do LHSKP, ale wykorzystuje ogólny wzór, która nie wymaga użycia tej samej liczby powtórzeń ani stałego odstępu czasu.
  3. Procedura Stumba-Murphy`ego-Cochrana (SMCP): Wzór na SMCP wymaga jednego wyniku w zakresie frakcji ujemnej, obejmującego czas t, liczbę jednostek ujemnych w odniesieniu do wzrostu r oraz liczbę powtórzeń n, przy jednym czasie ekspozycji w zakresie frakcji ujemnej i początkowej liczbie drobnoustrojów na powtórzenie, N0.

Aby uzyskać wyższy poziom ufności przy użyciu SMCP, zaleca się obliczyć wartość D jako średnią z co najmniej trzech przebiegów w zakresie frakcji ujemnej w celu potwierdzenia powtarzalności.

 

Charakterystyka odpowiedzi przeżycia-zabicia

Ta metoda wymaga łącznie 100 wskaźników biologicznych z 50 powtórzeń w 2 warunkach określonych jako czas, w którym wszystkie wskaźniki wykażą wzrost, oraz czas, w którym żaden wskaźnik nie wykaże wzrostu po ekspozycji w określonych warunkach.

 

Określenie wartości z

Wartość z jest równa ujemnej odwrotności nachylenia najlepiej dopasowanej krzywej prostoliniowej, określonej za pomocą analizy regresji. Wartość z pozwala użytkownikowi wyrazić równoważną bójczość dla procesów sterylizacji termicznej. Obliczanie wartości z jest jedynym sposobem wyrażenia zmierzonej bójczości w zmiennych warunkach procesu, które mogą obejmować zakres od masywnych wsadów wolno ogrzewających się do wsadów o niskiej gęstości, które szybciej osiągają ustalone warunki.

Wartość z można określić za pomocą tylko dwóch wartości D procesu. Jednak wynikowa wartość będzie miała szerokie granice przedziału ufności. Z tego powodu preferowane jest obliczenie wartości z, na podstawie trzech lub więcej wartości D procesu, jak określono w ISO 11138-3 .

 

Graficzne wykreślanie wartości z

Wartość z można określić graficznie, wykreślając log wartości D wobec temperatury w skali półlogarytmicznej. Krzywa najlepszego dopasowania będzie liniowa, a oszacowana wartość z jest ujemną odwrotnością nachylenia.

Najczęstszą wartością F jest F0, stosowana w sterylizacji ciepłem wilgotnym. F0 jest określoną wartością F dla równoważnych minut w 121,1 °C przy wartości z 10,0 °C. Stało się to światowym standardem projektowania procesu ciepłem wilgotnym. Wartości równoważne F zastosowano w cieple wilgotnym, cieple suchym, a ostatnio w procesach sterylizacji tlenkiem etylenu. Podczas walidacji i monitorowania procesów za pomocą wskaźników biologicznych, rzeczywisty czas procesu w dowolnej temperaturze jest obliczany w odniesieniu do określonej temperatury jako funkcja określonej wartości z dla tego konkretnego wskaźnika biologicznego. Pozwala to na integrację bójczości i służy do obliczania rzeczywistej wartości SLR dla procesu.

Ustalenie redukcji logarytmicznej spor

Krzywa temperatura-zabicie-czas jest metodą porównywania wartości F w skali logarytmicznej z temperaturą. Metoda ta pozwala wyrazić proces w odniesieniu do jego skuteczności w zmniejszeniu obciążenia sporami. Wartość F przedstawia czas równoważny w określonej temperaturze procesu, co w połączeniu z wartością D umożliwia obliczenie zmniejszenia liczby spor jednorodnej populacji o określoną ilość. Ten wynik jest bójczością osiągniętą w procesie, wyrażoną jako SLR i może być wyrażony jako log początkowej populacji spor N0, minus log końcowej populacji NF.

 

Obliczenie poziomu zapewnienia sterylności

Prawdopodobieństwo niesterylności jednostki z procesu kontroli drobnoustrojów jest wyrażone jako SAL.

Powszechnie akceptowany SAL wynosi 10–6, tzn. istnieje jedna na milion szans na posiadanie niesterylnej jednostki. Dlatego zaleca się, aby całkowita zintegrowana bójczość zapewniała więcej niż sześć równoważników SLR obciążenia mikrobiologicznego, które było sterylizowane.

Warunki hodowli wskaźników biologicznych

W ISO 11138-1 wymaga się od wytwórców testów biologicznych dostarczenia użytkownikowi informacji na temat warunków hodowli (tzn. czasu od zakończenia procesu sterylizacji do rozpoczęcia inkubacji). Jeśli użytkownik stosuje inne warunki hodowli, zaleca się, aby zostały zwalidowane przez użytkownika.

Procedury zaleca się wykonywać w określonym do tego celu obszarze laboratorium, zwracając należytą uwagę na technikę aseptyczną i dobrą praktykę laboratoryjną. Dobrą praktyką jest uwzględnianie ujemnych kontroli podczas każdego oznaczania przeprowadzanego z wykorzystaniem ogólnych obszarów laboratoryjnych dla tych oznaczeń. Jeśli do tego celu nie można znaleźć określonego obszaru lub istnieje ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, procedurę zaleca się wykonywać w określonej strefie krytycznej (np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub komorze z zabezpieczeniem biologicznym bez wymiany powietrza między strefą krytyczną a obszarem otaczającym, w których wskaźniki biologiczne lub drobnoustroje o takich samych lub podobnych właściwościach wzrostu są wytwarzane, pakowane lub postępuje się z nimi w inny sposób). Zaleca się przestrzeganie warunków hodowli rekomendowanych przez wytwórcę wskaźnika biologicznego. Jeżeli stosowane są warunki hodowli inne niż rekomendowane przez wytwórcę, to zaleca się je zwalidować, aby określić ich wpływ na działanie wskaźnika biologicznego.

Temperatura inkubacji wskaźników biologicznych

Zaleca się zawsze odnosić do oznakowania wskaźnika biologicznego w odniesieniu do zalecanej temperatury inkubacji. Niepowodzenie inkubacji wskaźników biologicznych w odpowiedniej temperaturze inkubacji może unieważnić wyniki badania.

Organizmy testowe, które zostały poddane ekspozycji w procesie sterylizacji, mogą wykazywać zwiększoną wrażliwość na zmiany temperatury inkubacji. Niektóre organizmy testowe mogą wykazywać zwiększony odzysk w temperaturach inkubacji poniżej zalecanej temperatury inkubacji i zmniejszony odzysk w temperaturach inkubacji powyżej zalecanej temperatury inkubacji. Z reguły, wskaźniki biologiczne Geobacillus stearothermophilus można inkubować w temperaturach o zakresie od 55 °C do 60 °C, a wskaźniki biologiczne Bacillus atrophaeus można inkubować w temperaturach o zakresie od 30 °C do 37 °C lub zgodnie ze specyfikacjami dostarczonymi przez wytwórcę.

Czas inkubacji wskaźników biologicznych

Wymagany okres inkubacji może się różnić w zależności od właściwości wskaźnika biologicznego i procesu sterylizacji; w ISO 11138-1:2017, zaleca się okres 7 dni dla wskaźników biologicznych dla ustalonych procesów. Zaleca się zapoznać z oznakowaniem wskaźnika biologicznego i innymi informacjami dostarczonymi przez wytwórcę.

Informacje dotyczące okresu inkubacji dostarczone przez wytwórcę wskaźnika biologicznego są zwalidowane przy użyciu określonych warunków ekspozycji i inkubacji. Warunki ekspozycji mogą się różnić od tych w pomieszczeniach użytkownika. Dlatego użytkownik może rozważyć weryfikację zaleceń wytwórcy wskaźnika biologicznego dotyczących czasu inkubacji, na podstawie polityki jakości użytkownika i jego procedur.

W przypadku niestandardowych lub nowych procesów sterylizacji nieobjętych aktualnymi Normami Międzynarodowymi, zaleca się zwalidować okres inkubacji zgodnie z aktualnymi wymaganiami krajowymi; w ISO 11138-1:2017, Załącznik B, zaleca się okres inkubacji wynoszący 14 dni.

Wytwórca wskaźnika biologicznego może walidować projekt połączenia nośnik spor/podłoże do odzysku (np. pasek spor sprzedawany z podłożem do odzysku jako zestaw lub zamknięty system wskaźnika biologicznego). Walidacja skróconego czasu inkubacji dla tego produktu nie powinna być powtarzana przez użytkownika końcowego, o ile użytkownik końcowy stosuje produkt z tym samym czynnikiem sterylizującym co stosowany w walidacji (np. projekt zwalidowany i stosowany dla tlenku etylenu). Jeśli użytkownik końcowy zamierza użyć połączenia nośnik spor/podłoże do odzysku/temperatura inkubacji, a połączenie to nie zostało zwalidowane przez wytwórcę (np. pasek spor użyty z podłożem do odzysku niesprzedawany jako część zestawu), to zaleca się, aby użytkownik końcowy walidował skrócenie czasu inkubacji przy użyciu określonego statystycznego planu pobierania próbek i procedury z wcześniej ustalonymi kryteriami akceptacji.

Zamknięte systemy wskaźników biologicznych mogą nie zawierać wystarczającej objętości podłoża, umożliwiającej odzysk po wydłużonych okresach inkubacji w niektórych warunkach badania, bez wysuszenia podłoży. Zaleca się skontaktować z wytwórcą w celu uzyskania instrukcji dotyczących sposobu przeprowadzania rozszerzonych inkubacji dla ich zamkniętych systemów wskaźników biologicznych.

Wytwórcy są odpowiedzialni za zapewnienie, że nośnik i opakowanie pierwotne zamkniętych systemów wskaźników biologicznych nie zatrzymują ani nie uwalniają wystarczającej ilości pozostałości środka sterylizującego do zahamowania wzrostu małej liczby organizmów testowych, które przeżyły (ISO 11138-1). Aby uzyskać więcej informacji, zaleca się skonsultować z wytwórcą.

 

Wybór podłoża wzrostowego

Większość wytwórców wskaźników biologicznych dostarcza bezpośrednio podłoże hodowlane lub podaje informacje dotyczące przygotowania odpowiedniego podłoża hodowlanego. Podłoże hodowlane wykorzystywane przez różnych wytwórców może się znacznie różnić; dlatego ważne jest, aby postępować zgodnie z zaleceniami wytwórcy wskaźnika biologicznego. W celu walidacji czasów inkubacji wskaźników biologicznych, naturalna zmienność podłoża hodowlanego sprawia, że wskazane jest sprawdzenie działania kilku serii podłoża i zarezerwowanie odpowiedniej ilości serii, które zapewniają pożądane działanie wzrostowe. Umożliwi to porównanie z nowymi seriami. Wybór odpowiedniego podłoża hodowlanego wymaga uwzględnienia wielu zmiennych, takich jak pH podłoża hodowlanego i obecność substancji hamujących, takich jak sole, wskaźniki pH lub antybiotyki. Inne substancje w podłożu hodowlanym mogą wpływać na odzysk organizmów testowych poddanych działaniu czynnika sterylizującego.

Podłoża hodowlanego dostarczanego przez użytkownika nie zaleca się przetwarzać nadmiernie, ponieważ przedłużona sterylizacja może wywoływać zmiany, które mogą wpływać na jego właściwości wspomagania wzrostu. Zaleca się wykazać zdolność podłoża hodowlanego do wspomagania wzrostu małej liczby drobnoustrojów. Każdą serię podłoża wzrostowego zaleca się sprawdzić za pomocą odpowiedniego badania wspomagania wzrostu i porównać z poprzednio stosowaną serią, aby oznaczyć spójność między seriami. Zaleca się, aby badanie wspomagania wzrostu obejmowało określony organizm testowy zastosowany we wskaźniku biologicznym.

 

Szkolenie personelu stosujących wskaźniki biologiczne

Wymaga się, aby personel odpowiedzialny za umieszczanie, odzyskiwanie, badanie i wszelkie inne postępowanie ze wskaźnikami biologicznymi, został odpowiednio przeszkolony. Szkolenie to zaleca się udokumentować, a odpowiedniość szkolenia zaleca się okresowo oceniać. Zaleca się, aby istniały pisemne procedury badania wskaźników biologicznych i postępowania z nimi, a także działań wspierających, takich jak przygotowanie i sterylizacja podłoża hodowlanego.

Jeśli stosowane są techniki aseptyczne, szczególną uwagę zaleca się zwrócić na szkolenie personelu w zakresie tych technik.

 

Przechowywanie i postępowanie ze wskaźnikami biologicznymi

Sprzedawca lub dostawca jest odpowiedzialny za wysyłkę lub transport do użytkownika i zaleca się aby zapewnił, że zmiany temperatury występujące podczas transportu nie będą miały negatywnego wpływu na oznakowaną charakterystykę oporności. Zaleca się, aby sprzedawca lub dostawca zawarł z użytkownikiem umowy dotyczące środków transportu, w celu zapewnienia odpowiednich warunków do utrzymania charakterystyk działania wskaźników biologicznych w trakcie transportu. Podobnie, jeśli użytkownik nabywa wskaźniki biologiczne i przechowuje je w centralnym magazynie w celu dalszej dystrybucji, to zaleca się, aby użytkownik zapewnił, że warunki podczas transportu są odpowiednie do utrzymania charakterystyk działania wskaźników biologicznych.

Zaleca się zawsze przestrzegać zaleceń wytwórcy dotyczących przechowywania i postępowania ze wskaźnikami biologicznymi. Nieprzestrzeganie tych zaleceń może negatywnie wpłynąć na integralność i działanie wskaźnika biologicznego i prowadzić do błędnych założeń dotyczących skuteczności procesu sterylizacji. Z reguły wskaźniki biologiczne zaleca się zawsze przechowywać w ich opakowaniach ochronnych, dopóki nie będą gotowe do użycia. Wskaźnik biologiczny jest dostarczany w postaci gotowej do użycia w systemie opakowaniowym, który chroni go przed zewnętrznymi wpływami mikrobiologicznymi. Zaleca się, aby podczas przechowywania wskaźników biologicznych uwzględniać temperaturę, wilgotność względną, wpływy chemiczne i światło. Wskaźniki biologiczne składające się z drobnoustrojów innych, niż niebezpieczne można obsługiwać bez ograniczeń i zaleca się, aby ich wysyłka i transport odbywały się zgodnie z międzynarodowymi przepisami dotyczącymi transportu bezpiecznych drobnoustrojów.

 

Utylizacja wskaźników biologicznych

Zgodnie z ISO 11138-1 wytwórca testu biologicznego do autoklawu jest zobowiązany do dostarczenia instrukcji usuwania. Inaktywowane wskaźniki biologiczne można usuwać jako odpady z gospodarstw domowych. Przeterminowane, niesterylne i nieużyte wskaźniki mogą być również usuwane jako odpady z gospodarstw domowych, jeśli jest to rodzaj bezpiecznego drobnoustroju. Jednak zaleca się postępować zgodnie z instrukcjami usuwania od wytwórców, które często wymagają sterylizacji przed usunięciem. Wskaźniki biologiczne można czasem zdefiniować jako odpady szpitalne.

 

 

[1] Odsyłacz krajowy: Skrót od angielskiego terminu „colony forming units”.